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呵呵,今天一大早收到通知,送Nature子刊的文章终于接受了。
这个project很不顺。从试验设计开始老板就认为CRISPR/HDR成功率太低,不让作。等到我说服他,好
几个月都过去了。设计时把我几十年的分子生物学和tissue culture经验,能想到的可能
改进成功率的方式都加进去了,才让老板同意我放手一搏。几个月后,终于作完了第一轮,还差点就没拿到我要的
东西:那天在显微镜下找得头昏眼花,没有任何克隆,就垂头丧气地给老板打个招呼,准备放弃了。回到实验室正想扔细胞培养皿的那一瞬间,突然想到举起来对着日光灯肉眼看了一下,一个白色的克隆就在培养皿的最边沿--最后证明这个克隆是一个基因的两个copy都按我设计的突变了。。。。
这一年来,又是mycoplasma污染(实验室的host cell line本身就污染了!),又是克隆不纯,搞得很头疼。最后稿子送出去了,作science这边的reviewer对突变子有兴趣,对方法没兴趣,意见一堆,要把method这一节砍掉;作方法的reviewer对突变子本身没兴趣,对方法上所有改进作用的思路都感兴趣,也认为有道理。但对我们没有和其它方法进行试验对比很遗憾,觉得作为方法的文章发表有欠缺。。。
老板说:你也好多年没发第一作者的文章了(上次发是2008年,JBC,还好被Faculty 1000选中了),今天回家开瓶酒喝吧。
不错不错,了结了这个,就可以全心全意接一个马上要毕业学生的project了。学生这个project刚发了Nature子刊,看能不能搞个grant。近十年实验室的所有grant都有我的影子。一个RO1的renewal全靠我筛出来的compound;一个R21在第一次申请失败后我插进去补数据,第二轮成功;一个DOD的grant虽然是学生为主,但筛选的第二轮的方法就是
我花了几个月来专为他develop的;最新的RO1 renewal也是把我上面的mutant cell lines的数据加进去,并且根据我的方法再提出新的idea后,第三轮才拿下来的。学生的这个project去年写了一个proposal,可惜没拿到钱。希望我接手后,现在文章也发表了,能和过去十年一样,有奇迹发生。我还需要5-6年的饭碗,把儿子的大学学费解决呢。
我的CRISPR/HDR方法可能对大多数人没有帮助。我是利用mutant的一个特点来筛选的。我用两个guide sequences把我的基因功能搞掉(我的细胞靠这个基因才能生长), 先筛transfected细胞,再用mutant的特性来筛选我要的克隆,成功率很高。挑选出来的克隆,70%是带mutation的。大约1/4是两个copy都按我设计的突变,1/2是有一个copy按我设计的突变,另外1/4原因不明。因NPG问我们有没有兴趣把方法发表在Scientific Data上,细节暂时不能说。
祝各位网友中秋快乐!
(二0一六年九月十五日)
一样不容易呢。我五六年才发一篇地一作者的文章。当然大老板手下容易得多。
亮妈,现在周末都在钓鱼。菜种完了,就开始秋钓了。crappie不错,数量和大小敢不上春天的,但每次都有20-30条,五到十斤的收获。线轻松几天,等下一个project开始,估计是冬天了,就天天在实验室干活。:)。