住在芝城
住在芝城，研究靶向治疗
疟疾是热带和亚热带地区广泛流行的寄生虫传染病。恶性疟对人体的健康危害最大，无免疫力患者(儿童和非疟区人口)易发展为重症疟疾，死亡率高，仅非洲每年就有超过百万儿童被夺去生命。20世纪60年代以来，由于恶性疟原虫对常用抗疟药氯喹等产生抗药性，在东南亚地区、南美洲和非洲蔓延，全球防治疟疾的形势十分严峻。疟疾防治也是军事医学的重要课题，仅以60年代美国−越南战争为例，疟疾造成了双方军队严重的非战斗减员。美国为此专门成立疟疾委员会加强研究力量，组织以华尔特里德陆军研究院为中心，联合英、法、澳大利亚等国的研究机构和欧洲的一些大药厂，开展抗疟新药研究。
应越南领导人的请求，根据毛泽东主席和周恩来总理指示，解决疟疾问题被列为一项紧急援外战备任务。国家科学技术委员会(以下简称国家科委)和中国人民解放军总后勤部(以下简称总后勤部)于1967年5月23日在北京召开有关部委、军队总部直属和有关省(自治区)、市和军区等单位负责人参加的“疟疾防治药物研究工作”协作会议，以开会日期为代号，将这项紧急军事项目简称为“523任务”或“523项目”。由国家科委为组长单位，总后勤部为副组长单位，会同卫生部、化学工业部、国防科学技术工业委员会和中国科学院组成全国523领导小组，在军事医学科学院设立全国523办公室；有关省(自治区)、市和军区也成立相应的地区领导小组与办事机构，全面领导规划和计划的制订、管理与组织协调[1]。
我国科技工作者在研制成功“防疟1号片、2号片、3号片”几种复方预防药应急供部队使用后，从传统中药中发现了青蒿素，开始了我国抗疟药创新历程。由于青蒿素化学结构新颖，能高效、速效治疗恶性疟和间日疟，对氯喹等抗疟药无交叉抗药性等特点，解决了当今抗药性恶性疟难以治疗的难题。为提高青蒿素疗效和溶解度，研究者发明了蒿甲醚、青蒿琥酯、双氢青蒿素等系列衍生物。为延缓疟原虫产生抗药性、提高治愈率和缩短疗程，又以青蒿素类药物与自主发明的化学合成抗疟药本芴醇、磷酸萘酚喹和后续研发的哌喹等组成青蒿素类复方药，世界卫生组织称之为“青蒿素复方疗法”(artemisinin-based combination therapy，ACT)，在全世界各地遏制恶性疟的行动中发挥着重要作用。
本章介绍我国科学家发现青蒿素和发明青蒿素类抗疟药及其复方的过程。在统一规划下，科学家群体互相配合，互通有无，各单位在不同的研发阶段各自发挥了重要的作用。在这一历史过程中，全国523领导小组及其办公室，以及其后的青蒿素指导委员会和国家科委，在领导和组织协调这项抗疟药物研发系统工程中起到了重要作用。
第一节 青蒿素的发现及其抗疟药的早期研发
当年研究抗疟新药的工作从两方面展开：一是选择已有化合物进行筛选和人工合成新化合物，先后合成了磷酸咯萘啶、本芴醇和磷酸萘酚喹；二是从中医药方面筛选天然化合物。在1967年制订的3年研究规划中，建议作为重点研究的7种中草药中就有青蒿 [2]。当年有的单位也对青蒿做过初筛，但未发现其抗疟作用，这可能和青蒿植物产地、品种不同，提取方法各异等因素有关。后来证实，只有来源为菊科植物黄花蒿(Artemisia annua L.)的中药青蒿才有抗疟作用；有效成分青蒿素的含量因南北产地、采收时间不同而差别很大；青蒿素在黄花蒿的花蕾前盛叶期的叶子中含量最高。这些关键因素也是在后来科研实践中被认识的。
1. 疟区民间治疟草药的调查研究
我国的中草药大致可以归纳为两大类，一类是历代本草和医籍等中医药文献中记载的中医用药，即传统中药；另一类是地区性民间草药。523项目成立了中医药专业协作组，他们在查阅中医药文献和民间经验资料的同时，分赴海南、云南边疆、广东、广西、四川、江苏、浙江等疟区，深入民间访问，收集治疗疟疾的单方、秘方和验方，采集中草药样品，在实验室初步制备，经动物药效及安全性试验，就地试用观察，试图从中找出可供深入研究的备选药物。如1967～1969年中国医学科学院药物研究所和军事医学科学院等单位，与云南、江苏和广东的科研人员组成民间药调查小组，在广东民间发现植物鹰爪[Artabotrys uncinatus(L.)Merr.]的根有抗疟作用，经实验研究和临床试用，疗效较好，在中国医学科学院药物研究所于德泉的主持下，与广州中山医学院、中山大学、中国科学院华南植物研究所协作，分离出有效单体鹰爪甲素，梁晓天、于德泉等[3]证明其为一种新型的倍半萜过氧化物。因植物资源缺乏，鹰爪甲素的稳定性又差，故未继续开发，但是鹰爪甲素的发现，对后来同属于倍半萜类过氧化物的青蒿素化学结构的确定有很大启发。
2. 疟疾单秘验方药物的筛选
1969年1月，中国中医研究院中药研究所(以下简称中药研究所)参加523任务。该院领导指定屠呦呦任组长，组员为余亚纲。他们两人都毕业于北京医学院药学系(今北京大学医学部药学院)，受过现代科学研究方法的训练，并都在中医研究院西医学习中医研究班毕业，了解本草学的发展史。同年4月，中医研究院编写了含有640余方的《疟疾单秘验方集》(油印本)[2]。同时，他们将从中遴选的单味中药或复方的提取物，交由军事医学科学院做鼠疟抑制试验，发现胡椒、辣椒加明矾的提取物对鼠疟的抑制率达80%以上。同年7～10月，屠呦呦和余亚纲、郎林福携胡椒和辣椒加明矾的提取物参加海南岛疟区现场试验工作，共进行44例临床效果观察，两药仅各有1例原虫转阴，最后，因效果不理想而终止研究(参考资料1，简称资料1，下同)。1970年初，全国523办公室安排军事医学科学院正从事523中草药抗疟研究的顾国明到中药研究所，与余亚纲合作进行中药提取和鼠疟筛选的研究[1]。屠呦呦因另有任务，未能继续参与组内的研究[4]。
3. 初识青蒿的抗疟作用
余亚纲和顾国明继续查阅文献并进行中药提取，开展鼠疟筛选。余亚纲以上海市中医文献研究馆整理的《疟疾专辑》和清代《古今图书集成医部全录》的“疟门”为主要参考资料，进行深入细致的分析归纳后，提出：“重点筛选药为乌梅、乌头、鳖甲、青蒿等”，认为这些药“有单方应用经验，在复方里也出现频繁，值得反复动物筛选”。他所列的表格第一个记述青蒿的方剂是葛洪的《肘后备急方》，用法：“青蒿一握，水二升，捣汁服”。余亚纲以“523组”的署名整理出《中医治疟方、药文献》手稿[2]。余亚纲和顾国明所做的中药提取物由军事医学科学院焦岫卿等做鼠疟筛选，据顾国明回忆：“挑选在抗疟中药方剂中出现频率较高者，作为我们筛选研究对象，其中包括青蒿、鳖甲等，经水煎或乙醇提取，送筛选组进行鼠疟筛选，发现青蒿具有一定的抗疟作用，大概在60%～80%的抑制率”(资料2)。正是余亚纲和顾国明首先通过实验证明青蒿的抗疟作用，为后人提供了有价值的参考。余亚纲把青蒿提取物的鼠疟抑制率较高的结果报告给了屠呦呦[2]。1970年9月，屠呦呦将青蒿列入筛选名单[2]。此后，余亚纲因接受其他任务被调离523课题，顾国明也回原单位工作。1970年9月至1971年5月中药研究所的中草药抗疟研究工作处于停滞状态(资料1，资料3)。
4. 青蒿抗疟有效部位的发现
1971年5月下旬，在广州召开“疟疾防治研究工作座谈会”，卫生部领导和523办公室一再强调523任务的重要性，于是中药研究所重新组织力量进行研究(资料4)。屠呦呦仍任组长，与组员钟裕蓉继续提取中药，他们经过100多个样品的筛选，不得不再考虑选择新的药物，同时又复筛过去显示效价较高的中药[5，6]。他们曾做过青蒿95%乙醇提取物，鼠疟抑制率仅为40%，后来他们改用常规乙醚提取，效价显著提高，鼠疟抑制率达到99%～100%，但毒性偏大。在去除其酸性部分后，得到抗疟效价高、毒性小的乙醚中性提取物(资料5)，青蒿抗疟研究由此取得了新进展。
1972年3月，在南京召开的523中草药专业会议上，屠呦呦代表中药研究所报告了青蒿的乙醚中性提取物对鼠疟抑制率可达100% 的结果(资料5)，引起全国523办公室和与会单位的关注。
青蒿的乙醚中性提取物(代号91#)经过动物毒性试验和人体试服，证明无明显副作用后，1972年8～10月，屠呦呦和戴绍德到海南岛进行临床观察，3种剂量组均有效，其中大剂量组(总剂量36g)疗效更明显。治疗间日疟11例(含混合感染1例)，全部有效；恶性疟9例，有效7例，无效2例(资料6)。在523办公室协调下，解放军302医院临床验证9例间日疟，也全部有效。临床试验共29例，获得了比较满意的结果[1]。
中药研究所通过动物模型和疟疾患者临床观察均证实了青蒿乙醚中性提取物的抗疟作用，尤其是治疗恶性疟的效果，为后来青蒿的深入研究提供了重要的依据。
山东省寄生虫病防治研究所得知这一信息后，1972年10月用当地的黄花蒿制得的乙醚中性提取物也证实了对鼠疟的良好效价[1]。1973年又在当地用于治疗间日疟，也取得很好的疗效[1]。
5. 抗疟单体青蒿结晶Ⅱ的发现
1972年8月，屠呦呦在海南岛观察乙醚中性提取物的临床疗效期间，其组员倪慕云将青蒿乙醚提取物中性部分进一步纯化，但用氧化铝进行柱层析时，未得到任何值得注意的单体。组员钟裕蓉改用硅胶柱层析，石油醚−乙酸乙酯梯度洗脱，于1972年11月8日，分离得到3种结晶，编号为结晶Ⅰ、结晶Ⅱ和结晶Ⅲ(资料1，资料3)。药理室叶祖光进行鼠疟筛选，证实结晶Ⅱ是唯一有抗疟作用的单体，该结晶50～100mg给小鼠灌胃，可使鼠疟原虫转阴。后来中药研究所将此结晶Ⅱ改称“青蒿素Ⅱ”(资料1，资料3)。
6. 青蒿素Ⅱ临床试验初步显示对间日疟有效
中药研究所用柱层析分离青蒿素Ⅱ的数量有限，在做了小鼠急性毒性试验后就进行健康人试服。由3名科研人员试服青蒿素Ⅱ，3天总剂量1例为3.5g，其余2例均为5g，经心电图、脑电图、肝功能、肾功能、血液生化和尿常规检查，服药后均无明显变化[7]。1973年9～10月由李传杰带领临床小组到海南岛昌江地区对青蒿素Ⅱ进行临床观察。据临床报告记录：“其中外来人口间日疟3例，胶囊剂总剂量3～3.5g，平均原虫转阴时间为18.5h，平均退热时间为30h，复查3周，2例治愈，1例有效(13天原虫再现)。外来人口恶性疟5例，1例有效(原虫7万/mm3以上，片剂用药剂量4.5g，37h退热，65h原虫转阴，第6天后原虫再现)，2例因心脏出现期前收缩而停药(其中1例首次发病，原虫3万/mm3以上，服药3g后，32h退热，停药1天后原虫再现，体温再升高)，2例无效”(资料7)。此次青蒿素Ⅱ临床试验初步看到对间日疟有一定效果，但未能确证对恶性疟的疗效。1974年，中药研究所由于诸多原因未能提取青蒿素Ⅱ，未再进行临床试验。
7. 黄蒿素治疗恶性疟显特效
云南省药物研究所(以下简称云南药物所)的罗泽渊受中药研究所青蒿乙醚中性提取物临床疗效的启示，试图从同属植物中寻找有抗疟作用的药物，1973年3～4月她将采集到的苦蒿用石油醚、乙醚、乙酸乙酯和甲醇连续提取，得到多种结晶。从乙醚提取物中得到的编号为“苦蒿结晶Ⅲ”，黄衡用鼠疟抑制试验证实其有显著抗疟作用。后经植物学家吴征镒鉴定，“苦蒿”是黄花蒿的大头变型，简称大头黄花蒿(Artemisia annua L. f. macrocephala Pamp.)，遂将“苦蒿结晶Ⅲ”按原植物名改称“黄蒿素”(1978年以后统一称青蒿素)。同年6月，由于当地原料不足，到四川药材公司采购到酉阳地区产的中药青蒿(植物黄花蒿)，其黄蒿素含量比大头黄花蒿高10倍。他们分离得到的黄蒿素为药理、化学和临床研究提供了充足的试验用药。1973年10月完成了黄蒿素的药效和毒性试验，证明对鼠疟疗效高，毒性不明显[1]。该所詹尔益、罗泽渊等进而建立了黄蒿素的“溶剂汽油法”提取工艺，为大规模生产奠定了基础[1]。
1973年秋，全国523办公室的周克鼎和中药研究所张衍箴到云南药物所了解大头黄花蒿研究进展情况和他们的提取方法。罗泽渊向他们做了提取分离黄蒿素的详细介绍，并送了一些黄蒿素给中药研究所作为对照品。1975年，中药研究所刘静明等到云南药物所交流学习提取工艺，了解到黄花蒿优质原料产地等情况，使中药研究所得以自行解决青蒿素供药问题(资料8)，体现了单位之间的互相支持。
1974年9～10月，云南临床研究组到云县进行黄蒿素治疗恶性疟临床试验，因难找到病例，未有结果。全国523办公室的领导张剑方等到现场检查工作，临时决定将黄蒿素的临床试验任务交给正在云南省耿马县医院开展脑型疟救治研究的广州中医学院523小组[1]。李国桥从最初3例患者的试验中观察到，患者口服黄蒿素后，恶性疟原虫纤细环状体停止发育并迅速减少的现象，认定黄蒿素对恶性疟原虫的速杀作用远超奎宁和氯喹。为了对治疗恶性疟的疗效尽快作出评价，他立即制订黄蒿素鼻饲给药救治脑型疟的方案，派人到中缅边境沧源县南腊镇卫生院设点，争取在耿马县人民医院和沧源县南腊镇卫生院能收到脑型疟病例进行试验。10～12月，他们共收治了18例患者，其中有1例脑型恶性疟、2例黄疸型恶性疟和11例非重症恶性疟，4例间日疟，全部迅速临床治愈(资料9)。这是首次在临床上证实青蒿素治疗恶性疟的疗效及其速效、低毒的特点，是对青蒿素临床应用价值的重要发现[1]。他们建议尽快制成注射剂用于救治重症疟疾。
山东省中医药研究所的魏振兴受到北京的青蒿乙醚中性提取物临床有效的启示，1973年11月，从当地的植物黄花蒿中提取出有效单体，命名为“黄花蒿素”(1978年以后统一称青蒿素)。1974年5月和10月，他们在山东巨野县用黄花蒿素治疗间日疟19例，“原虫迅速转阴，症状迅速控制，未见明显副作用”(资料10)。
上述1973年青蒿素Ⅱ的临床试验结果与1974年黄(花)蒿素大不相同。由于当时中药研究所为临床试验提取分离青蒿素Ⅱ遇到诸多困难，因而难免混有相当量的杂质，加以对刚获得的青蒿素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的认识尚粗浅，又误认为“青蒿素Ⅲ与青蒿素Ⅱ以等量配伍之后，可减少青蒿素Ⅱ用量，仅用原剂量的二分之一，即可显示相同的(鼠疟)效价”(资料11)，因而临床试验用的青蒿素Ⅱ可能混有较多的青蒿素Ⅲ就可以理解了。青蒿素Ⅱ和黄蒿素对恶性疟的疗效显然不同已如前述，就是从间日疟的剂量和疗效分析，青蒿素Ⅱ与黄(花)蒿素也有很大的不同。青蒿素Ⅱ 3天疗程总剂量为3～3.5g，临床治愈3例中，1例13天就复燃；山东的黄花蒿素3天总量0.6～1.2g，19例全部迅速临床治愈；云南的黄蒿素治疗4例间日疟，只用1天疗程，总量0.2～0.3g，都迅速临床治愈。临床事实表明，青蒿素Ⅱ中含有的真正青蒿素太少。
综上所述，中药研究所于1972年首先分离到有效单体青蒿结晶Ⅱ，1973年的青蒿素Ⅱ临床试验初步看到对间日疟有一定效果，但未能确证对恶性疟的疗效；1974年云南、山东两地对14例恶性疟、23例间日疟的临床观察，初步证实青蒿素治疗疟疾尤其是恶性疟和救治凶险型疟疾的速效远超氯喹和低毒的优点。全国523办公室认为云南、山东的临床试验结果“对深入开展青蒿研究起到很大的推动作用”(资料12)，为在全国开展更大范围合作研究的决策提供了重要依据[1]。
致谢：本节内容由当年523任务组织者和众多参与者，提供的大量原始资料和回忆记录写成。成文后又得到施凛荣、刘天伟、宁殿玺、焦岫卿等编委成员的修改和建议，黎润红提供参考意见，在此一并致谢。
参 考 文 献
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(曾美怡 李国桥 李 英 李泽琳)
