新型冠状病毒核酸检测阳性率低和速度慢的原因分析和对策(修改稿1）
作者：柳涯客
目前，新型冠状病毒的疫情仍然十分严重，截至2月14日，中国确诊病例63936，疑似病例10109，死亡1381例, 治愈6864例 。前湖北省委书记蒋超良2月8日曾要求：“两天内检测完武汉所有疑似患者”。而工程院的副院长、中国医学科学院院长王辰院士接受央视《新闻1+1》采访时披露：“目前核酸检测的阳性率只有30-50%”。也就是说，同一个临床疑似肺炎病人，平均检测2-3次或以上才有一次阳性结果。
据我了解，现时武汉的日均核酸检测能力约为7000/天。从疫情公布以来，确诊病例每日攀升，疑似病例数仍有1万多例。随着全国各地陆续复工，病毒检测的任务会更加繁重。有没有可能两天内检测完武汉所有疑似患者？完全可能，但我们需要改进核酸检测的技术和方法。
- 核酸检测的主要问题是阳性率低和检测速度跟不上。我认为阳性率低的主要原因是取样和病灶距离有点远。新冠病毒的易感病灶是下呼吸道(气管、主支气管)和肺。现在取样主要在上呼吸道(鼻、咽、喉)。虽然肺泡灌洗液检测的阳性率最高，但有创，费时和技术要求高而无法推广。新型冠状病毒感染者以干咳为主，痰少又取不到样, 所以咽拭子是我们目前取样的主体。
- 病毒核酸检测包括取样，核酸提取和RT-定量PCR三个主要步骤。我们需要成立科技攻关小组，做多方面的尝试，攻克核酸检测的技术和方法的限制，在近期集中解决取样中病毒核酸的数量和质量不够理想的问题, 我的分析和对策是：
1. 改进取样和处理方式, 提高病毒核酸数量和质量
1）咽拭子采用标准3个拭子3位置点取样
最敏感的核酸检测实时（定量）RT-PCR方法大概只能检出5个病毒以上的感染。取样病毒数量少是核酸检测的阳性率低的关键原因之一。咽拭子说白了就是护士拿棉签刮一下咽部送检。另外病程的时间段（早期，中期和危重期), 刮取的位置和手法个人不同也是导致30-50%阳性率的原因。提高检出率的核心在于首先提高取样病毒数量。
如果采用标准取样点，固定3个拭子取样的位置在咽部9点，12点位和3 点位，可以避免护士刮取位置和手法不同所造成的采样差异。3拭子合并送检可能增加取样病毒数量3倍，从而提高阳性率。
2）采用两个鼻拭子取样
建议病人做鼻拭子取样, 有证据表明鼻拭子的阳性率好于咽拭子。如果验证明确的话所有咽拭子都可以被鼻拭子取代。对于难检病人甚至可以考虑咽拭子和鼻拭子合并送检的方法。
3）取样途径多种化, 院外首次检测阴性病人和住院病人增加血检
虽然血液细胞不是病毒最易感的细胞，但全身器官中肺部耗氧最多(超过心和脑)。肺的血液供应非常丰富而且血液中有丰富的免疫淋巴细胞。因此，如果新型冠状病毒感染到肺，收集病人的血做核酸检测就十分合理。
建议院外首次检测阴性病人和住院肺炎病人抽取5-10毫升血液送检。住院病人抽取的血样可以一半做核酸检测，一半做抗体检测。此外，轻症病人自己取样洗鼻液, 漱口液也可以考虑。洗鼻的方法如同过敏性鼻炎的洗鼻。
鼻拭子和咽拭子少量洗脱液直接变性以及血清变性后离心直接做RT-PCR也可一试。
4) 改进提取RNA的方式
2020年1月24日Huang C等发表在Lancet的文章中用了住院肺炎病人的血做核酸检测，阳性率为15%。是不是不值得提倡？在我看来，他们的方法可以改进，例如加大血的用量（从80微升加大为240微升甚至更多），减少最后洗脱溶液（50微升变为10微升），这样的改进可以提高病毒数量15倍(见附1)。即使仍然是15%阳性率，依然可以作为其他方法的补充。
5）避免运输和待检过程中降解以保证提取核酸的质量
另一方面，增加核酸检测的阳性率需要提高提取的病毒核酸质量。由于降解核酸的酶特别顽固。平常灭菌采用蒸汽100度消毒5～10分钟或烤箱消毒120度消毒15～20分钟就可以。灭活核酸酶需要300度2小时。所以操作需要十分小心，一不留意，核酸就降解了。武汉大学人民医院检验科主任李艳介绍: “我们一开始先把病毒灭活，56度45分钟把它灭活完了以后，没有活性了我们再来做核酸的检测”。我觉得这种方式比较危险，因为1）人体体液富含核酸酶; 2) 核酸酶起作用的最佳温度也是60度, 非常接近56度, 所以一定慎用不加变性剂条件下56度加热45分钟的灭活方式。
运输和待检过程长达数小时至2天，期间的病毒RNA降解也是需要考虑的因素。美国CDC要求48小时内检测的样品保存在4度，超过48小时就冷冻。我的一个改进对策是：采样和加病毒裂解液灭活由护士或护工进行，然后密封常温运输至检测室，加灭活剂后能防止病毒RNA降解。
6) 检测试剂盒 (核酸和抗体检测比较)
根据美国CDC关于SARS实验室检测的一些经验，血液以外的样品较敏感的还是实时RT-PCR为基础的核酸检测试剂盒为好，在合适的时间段内检测血液抗体也不错。感染一周内抗体尚未出现，血液检测抗体效果不佳。临床症状出现3周后的病人血液核酸检测反而不如抗体检测敏感。
另外，美国CDC要求核酸检测试剂盒内一定要有3个对照：阳性，阴性和核酸质控对照, 否则影响检测效果的评价。
2. 提高新型冠状病毒核酸检测速度
武汉的日均核酸检测能力为7000/天, 限速环节主要在核酸提取, 改进对策有这几个方面：
1）操作安全等级和放权
新型冠状病毒在中国定为乙类甲管，即“乙类传染病按照甲类传染病的预防控制措施进行管理”。但是预防控制可以按照甲类，核酸检测应按乙类。美国FDA2月4日前，所有的新型冠状病毒核酸检测都要求送到美国疾控中心（CDC）检测，等待时间为2-5天。FDA2月4日紧急下放新型冠状病毒检测权限到各地区CDC核准授权实验室，加快了检测进程。只是美国只有15例感染者，没有太大的检测需求。我个人认为病毒灭活后的操作也可以考虑在P2+的实验室做。
2) 如有必要成立集中检测室提高检测通量
病毒灭活后密封常温运输至“云神山检测室”进行核酸提取。云神山检测室是我起的名字，大概可以容纳100个检验员，每个人8小时可以提取200个样品的核酸。集中能提高机器的使用效率并提高检测通量。
3）检验员人数
找不到足够检验员怎么办，武汉有60多家医院，每个医院抽2个人就是120人。全国已支援1万多医务人员，增加支援100个检验员应该可行。另一个选择则是招募100个生物研究生或医学本科生（上过生物实验课），培训一天就可以胜任。
4）检测机器数量
2个检验员和一台实时（定量）PCR机器8小时大概能人工检测8板近1000个样品(384孔/板接近120样品/板), 140个检验员20台机器一天就可以人工检测2万个样品。
5) 改进核酸提取方法
核酸提取方法也需要改进，基于Huang C博士和Zymo公司方法我简化了一些过程并增加了普适性(附1)。病毒灭活剂(TRIZOL)的主要成分是苯酚。苯酚的作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白变性，释放核酸物质。由于苯酚不能完全抑制RNA酶活性，TRIZOL中还加了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、贝塔巯基乙醇来抑制内源和外源RNA酶。
以上是我的关于提高阳性检出率和检测速度的分析和对策，希望转告有关人员。大疫当前，人应不分海内外群策群力共克时艰。如果这些建议有所帮助, 也是我们大洋彼岸华人科学家为早日结束新型冠状病毒肆虐作出的一份贡献。
2020年2月14日
附1.微量总 RNA 提取方法(另需TRIZOL裂解试剂)
试剂盒组成:
洗涤液 1, 第一次使用前按说明加指定量乙醇 (无水乙醇, 95-100%）;
RNA 洗涤液 2, 第一次使用前按说明加指定量乙醇;
RNase-free H2O 室温 6 ml; 1 号柱, 收集管（2ml）
特性:
1. 样品来源：TRIZOL等类似试剂裂解的混合样品。
2. 样品范围：≥17核苷酸。
3. RNA结合量：每个柱子可最多结合10μg的RNA。
操作步骤:
以下离心如无特殊说明均在10,000-16,000 x g范围内离心1分钟。
（I） 样品裂解匀浆（混匀后静置5-10分钟）
1) 全血样品：直接取1体积的液体样品，加入3 倍体积裂解液（推荐240μl全血加入720μl裂解液），充分振荡并且混匀。
2) 洗鼻液，漱口液离心2分钟 (1000RCF/分)弃上清，细胞沉淀加300μl TRIZOL裂解液（或拭子洗脱液加入3 倍体积裂解液），充分振荡并且混匀。
（II）样品纯化：
1. 加入等体积(95-100%)的无水乙醇到上一步TRIZOL裂解液中混匀。
2. 一次或重复几次将上述混合物放入套在收集管内的1号柱里，离心1分钟，去除滤出液。
3. 添加400μl的RNA洗涤液2到1号柱里，离心1分钟，去除滤出液。
4. 添加400μl的RNA洗涤液1到1号柱子里，离心1分钟，去除滤出液。
5. 添加700μl的RNA洗涤液2到1号柱子里，离心2分钟以免洗涤液残留。
6. 取出1号柱，放入一个无RNA酶的离心管中，在吸附膜的中间部位加10-15μl RNase-free
water，室温放置2分钟，离心1分钟洗脱RNA。
注：此方法根据Huang C等论文(Lancet,Jan 24，2020) 和Zymo公司方法改编
