手动过反相柱

在进行反相柱层析时，梯度洗脱开始以大比例极性水溶液开始，由于C18反相硅胶填料表面疏水性，疏水官能团就会发生蜷缩，因此使用前需要用极性有机溶剂活化（疏水官能团得以舒展），再过渡到水溶剂（保持其吸附活性）。活化平衡的步骤必不可少，否则会明显影响分离效率。

一、首先在柱子地下铺一层1cm厚的石英砂。

二、装入C18反相硅胶，甲醇润柱，活化硅胶，此步骤必不可少。

三、完全润湿硅胶后，上层留少量甲醇，轻轻敲击，使填料上层更加平整。

四、平整后，将甲醇液面压到硅胶上沿，上层加入2cm厚的沙子。

五、用过柱体系的水相置换柱子里的溶剂，准备上样。

一般情况下，湿法上样就可以了，最好用水相体系溶解样品进行上样，如果溶解度不好，可以加入少量的有机相促溶。上样后，加入展开剂梯度洗脱，加入溶剂时不要将上层的沙子冲散。注意事项：由于反相柱的压力比普通的正相柱大很多，整个操作过程要在通风橱中进行，并且加压时将通风橱拉低，安全第一。梯度洗脱过程中，可以利用正相TLC监测反应，如果爬不起来可以尝试一下EA:AcOH=200:1体系。

六、柱层析结束后，利用甲醇冲洗柱子，下次备用。

 

常用的水相体系：0.1%TFA水溶液，0.1%碳酸氢铵水溶液。

有机相体系：乙腈，甲醇。