活体光学脑成像与神经科学研究

     活体光学脑成像是指动物在活体状态下，利用光学手段对脑内某种特定结构或功能进行成像并对图像进行收集和分析的过程。 图像产生于荧光信号，荧光信号可以是自发荧光或人工标记荧光。 人工标记荧光是目前活体光学成像的主要手段，它的产生可以通过化学或生物方式。化学标记是指利用带有荧光集团的有机物与某种细胞、亚细胞结构或细胞内离子的特异性结合来进行成像的手段；生物方式， 可以应用病毒感染或构建转基因动物的方法，在神经细胞内表达特异性荧光蛋白，这种荧光蛋白通常是指示器蛋白，即它的荧光信号可以反应某一特定的生物学过程，这样通过对荧光信号的记录，就可以对某一特定的细胞结构或功能进行成像研究。

     大体上来讲，活体光学脑成像分为细胞或亚细胞水平成像和广域成像两大类。细胞水平成像主要应用双光子显微镜，在一个较小范围的脑皮层内（一般小于1×1mm²）对标记的细胞、亚细胞结构或钙离子浓度变化进行成像。 由于神经细胞内钙离子水平骤然升高反应动作电位的形成，因此神经元钙离子成像成为在细胞水平观察神经元放电主要手段；另外一种是广域成像，指在一个较大的脑皮层区域内（以小鼠为例，可达8×8mm²）^【1】，对某一个脑区或数个脑区的神经电活动，从介观的水平进行观察。尽管它不能观察到单一神经元的放电活动，但对于了解脑作为一个整体的功能，例如在自发或感觉诱发状态下，神经网络模式的变化，具有特殊的优势.

        神经元钙成像       神经元内钙离子浓度的骤然增加是神经元动作电位的标志，通过荧光标记来显示细胞内钙离子浓度的变化，从而了解个体神经元的放电过程，是神经元钙成像的基本原理。早期的神经元钙成像应用有机荧光染料与钙离子的特异性结合而显示钙离子浓度的变化，其缺点是有机荧光染料代谢快，因此难以在长时间内观察神经元的放电特征。GCaMP的出现使钙离子成像技术发生了革命性的改变. GCaMP是由绿色荧光蛋白、钙调蛋白和肌球蛋白轻链激酶的一段肽链组合成的一个融合蛋白, 具有钙离子指示器的功能, 它可以感受细胞内钙离子浓度的变化, 发出相应的荧光信号。通过病毒转染技术,可以在脑特定皮层区域的神经元内表达这种蛋白, 运用双光子显微镜技术,就能在活体情况下观察到神经元钙离子的图像信息,从而将神经元的放电显示在图像中。由于病毒转染后可以稳定表达数月时间,因此可以进行长时间的图像研究。通过转基因技术使GCaMP稳定表达于动物基因组中，通过与不同的启动子连接，既可以使GCaMP表达在所有神经元中，也可以在脑皮层的特定层次选择性地表达。GCaMP小鼠已经成为神经元钙成像的主要研究工具，应用非常广泛。举例来说，以往研究位置细胞主要应用电生理结合动物位置点记录，其缺点是单一细胞记录。如果将钙离子成像技术和位置点记录结合，就可以同时在一个活体动物上记录到数百个位置细胞^【2】；如果扩大开颅的范围，则可以在更为广泛的脑皮层范围来寻找位置相关细胞。另外，可以把钙离子成像技术和传统的动物行为学研究手段结合，来研究感兴趣脑区的功能，比如学习记忆与海马皮质，行为决定与前额皮质，位置信息处理与压后皮质等等。

          树突和树突棘成像     利用高分辨率的双光子显微镜， 可以在表达绿色或黄色荧光蛋白的神经元中清晰地显示树突和树突棘等结构。树突棘是轴-树突触结构中形成突触后膜的结构。如果对活体动物脑内某一区域脑皮层的树突棘进行动态观察，在一段时间内了解其形成和消失的动态变化过程，则在一定程度反应了突触结构的变化。突触是神经元联系的主要方式，突触的动态改变反应了神经元结构上的可塑性，与学习记忆过程密切相关。如果将动物行为学研究（如记忆的形成）或动物疾病模型（如早老性痴呆）与树突棘成像结合^【3】，就可以对记忆形成的结构基础或早老性痴呆的显微病理解剖改变有更为深入的认识。

          血管和血管神经单位成像    通过向动物静脉内注射荧光染料标记的葡聚糖，可以在活体状态下清晰地显露脑血管的结构，测量微血管管径，红细胞流速等指标；如果用有机染料如Rhod2-AM.或转基因技术特异性的标记星型胶质细胞内的钙离子，则可以显示微血管和星型胶质细胞足突形成的血管神经单位^【4】。是活体状态下研究微血管神经单位、血脑屏障动态变化的有力手段，可应用于脑卒中、脑创伤和脑肿瘤的研究。

         神经发生成像      通过特异性标记海马神经前体细胞，显微手术暴露海马CA1 区域，就可以在双光子显微镜下动态观察活体小鼠海马区神经前体细胞的增殖、迁移和分化过程， 对深入了解成体海马的神经发生有着重要意义^【5】。

          电压敏感性染料活体成像        这是一种广域成像技术。电压敏感性染料是一种可以和细胞膜特异性结合的有机荧光物质，它可以嵌入到细胞膜的磷脂双分子层中，感受快速变化的膜电位变化，并依据膜电位的高低，释放出相应强度的荧光信号。通过快速照相机的摄取，就可以获取与膜电位变化相关的动态图像。其时间分辨率可以达到毫秒级别，空间分辨率也可以达到50微米。尽管不是细胞水平的成像，但是由于使用照相机技术，就可以在一个更大的范围内记录脑皮层局部场电位的变化。比如在小鼠， 最大可以在8×8mm² 的范围内进行记录，这几乎包括了大部分背侧脑皮层区域。脑的功能活动，比如感觉信息处理，认知，学习和记忆以及行为决定等都是一个众多脑区域共同参与的过程，因此在一个较为广泛的区域内记录局部场电位的变化，对于了解不同脑皮层区之间的相互联系以及神经网络模式的形成和变化有着极为重要的意义。例如，通过对不同感觉形式刺激下脑皮层反应模式变化的特征观察，发现不同刺激形式下，皮层的反应模式具有类似的特征，即神经冲动具有从初级感觉区向联络区皮层传递的特点，这种神经网络模式也可见于没有刺激下的自发放电^【1】。结合光遗传学技术，可以研究直接脑皮层在激光刺激情况下神经网络模式的变化^【6】。

          慢性广域成像     不同于电压敏感性染料活体成像，慢性广域成像应用转基因动物，在神经元内表达荧光标记的膜电位敏感蛋白、神经递质谷氨酸浓度指示蛋白或钙离子敏感蛋白，通过感受膜电位变化、谷氨酸释放或钙离子浓度变化，反应神经元的电活动。由于荧光信号强，不需要移除颅骨也可以记录信号，所以只需将头皮和软组织去除后就可以在一个较大范围成像^[7]。尽管这种技术在时空分辨率上与传统的电压敏感性染料成像还有差距， 但它最大的优点是可以在一个相当长的时间（数月）进行清醒记录，因此可以把广域成像技术与行为学研究结合。例如研究动物在学习记忆过程中脑电活动在介观水平上的变化。

           活体光学成像技术的发展虽然只有数十年，但已经显示了其记录范围广阔、时空分辨率高等优点。它可以与传统的行为学研究、电生理技术结合，也可以与现代光遗传学技术结合，在神经科学研究中起着越来越重要的作用。现代显微镜技术的快速发展使大范围和深部脑结构成像成为可能；随着小型显微镜（Miniscope）技术的发展，结合自聚焦透镜（Gin lens）,可以在动物自由活动时进行深部脑结构的细胞水平成像^【8】，这种技术在神经科学研究中显示了巨大的潜力。

参考文献

1. Mohajerani MH *, Chan, AW *, Mohsenvand M, LeDue J, Liu R, McVea D, Boyd J, Reimer M, Wang YT, Murphy TH (2013). Spontaneous intracortical activity alternates between sensory motifs defined by region-specific axonal projections. Nature Neuroscience 16;1426–1435 
2. Mao D, Neumann AR, Sun J, Bonin V, Mohajerani MH, McNaughton BL (2018) Hippocampus-dependent emergence of spatial sequence coding in retrosplenial cortex. PNAS, 115(31):8015-8018.

 

3. Chengyu Zou1,  Yuan Shi1, · Jasmin Ohli · Ulrich Schüller .Mario M. Dorostkar · Jochen Herms1. Neuroinflammation impairs adaptive structural plasticity of dendritic spines in a preclinical model of Alzheimer’s disease. Acta Neuropathol DOI 10.1007/s00401-015-1527-8.

 

4. Cam Ha T. Tran and Grant R. Gordon* Acute two-photon imaging of the neurovascular unit in the cortex of active mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. February 2015 Volume9 Article11 .

 

5. Pilz GA, Bottes S, Betizeau M, Jörg DJ, Carta S, Simons BD, Helmchen F, Jessberger S. Live imaging of neurogenesis inthe adult mouse hippocampus. Science. 2018 Feb 9;359(6376):658-662.

 

6. Lim DH, LeDue J, Mohajerani MH, Vanni MP, Murphy TH (2013). Optogenetic approaches for functional mouse brain mapping. Frontiers in Neuroscience 10;7:54 PMID: 23596383.

 

7. Silasi G, Xiao D, Vanni MP, Chen AC, Murphy TH. Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice. J Neurosci Methods. 2016 Jul 15;267:141-9. doi: 10.1016/j.jneumeth.2016.04.012. Epub 2016 Apr 19.

 

8. Zhang L, Liang B, Barbera G, Hawes S, Zhang Y, Stump K, Baum I, Yang Y, Li Y^1,4, Lin DT^1,5. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Curr Protoc Neurosci. 2019 Jan;86(1):e56. doi: 10.1002/cpns.56. Epub 2018 Oct 13.