RACE法克隆全长基因cDNA的几个实战心得

RACE法克隆全长基因cDNA的几个实战心得

 

1， RNA质量

尽管手册上有强调，但要多高的质量呢？其实只要用普通的琼脂糖电泳检查一下就足够：量足没有弥撒的小分子就OK了。至于是否一定要用mRNA, 倒是不一定，至少对我的几个基因而言是如此。

 

2，起始RNA的量

用NANO测其A260/280的值，得其浓度，KIT手册上说是取1ug, 那就取1ug。不要想着目的基因的拷贝数可能很稀少，就多加RNA。这样，其实得不偿失：我一开始用大约4倍的量，结果老得到一团弥撒，即使看见了几条主带，大小也差不多，克隆测序后，得到一堆莫名其妙的其他序列，一个目的片段都没有得到，郁闷而且浪费时间和心情。记住，在这种情况下，并非越多越好。

 

3，引物的设计

手册上说最好是用26bp长的引物。我也设计了几对，包括26bp长的，也有用PRIMEREXPRESS(ABI的Realtime引物设计软件) 设计的19-20bp长的引物，实际比较之下，长的引物并无任何优点：我的几个5端片段都是用短的引物得到。不用长的，只用好的。

 

4，目的片段的识别

一般而言，目的片段出来的时候，基本上不会有什么杂带。也许会淡一点，但肯定是一条，或两条很sharp的带。也抱着死马当活马医的侥幸心理，割了N条这样的条带，结果NND一根都不是目的条带。

 

5，TOUCH还是RACE1

TOUCH一般而言是能得到更特异的带，虽然可能会有例外。如果基因数目不是很多，建议同时做TOUCH和RACE1。

 

6，还有就是要有耐心和毅力：RACE本身是很POWERFUL的，但有时如果觉得cDNA不行，就重新做一次。因为如果TOUCH和RACE1都做不出来的话，可能就是cDNA不行。至于为什么会不行，呵呵，管它呢！

 

7，RACE那一套可以自己准备。分别购买，这样就不用担心只能做7次了。