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RACE法克隆全长基因cDNA的几个实战心得

(2005-09-27 10:08:25) 下一个

RACE法克隆全长基因cDNA的几个实战心得

 

1 RNA质量

尽管手册上有强调,但要多高的质量呢?其实只要用普通的琼脂糖电泳检查一下就足够:量足没有弥撒的小分子就OK了。至于是否一定要用mRNA, 倒是不一定,至少对我的几个基因而言是如此。

 

2,起始RNA的量

NANO测其A260/280的值,得其浓度,KIT手册上说是取1ug, 那就取1ug。不要想着目的基因的拷贝数可能很稀少,就多加RNA。这样,其实得不偿失:我一开始用大约4倍的量,结果老得到一团弥撒,即使看见了几条主带,大小也差不多,克隆测序后,得到一堆莫名其妙的其他序列,一个目的片段都没有得到,郁闷而且浪费时间和心情。记住,在这种情况下,并非越多越好。

 

3,引物的设计

手册上说最好是用26bp长的引物。我也设计了几对,包括26bp长的,也有用PRIMEREXPRESS(ABIRealtime引物设计软件) 设计的19-20bp长的引物,实际比较之下,长的引物并无任何优点:我的几个5端片段都是用短的引物得到。不用长的,只用好的。

 

4,目的片段的识别

一般而言,目的片段出来的时候,基本上不会有什么杂带。也许会淡一点,但肯定是一条,或两条很sharp的带。也抱着死马当活马医的侥幸心理,割了N条这样的条带,结果NND一根都不是目的条带。

 

5TOUCH还是RACE1

TOUCH一般而言是能得到更特异的带,虽然可能会有例外。如果基因数目不是很多,建议同时做TOUCHRACE1

 

6,还有就是要有耐心和毅力:RACE本身是很POWERFUL的,但有时如果觉得cDNA不行,就重新做一次。因为如果TOUCHRACE1都做不出来的话,可能就是cDNA不行。至于为什么会不行,呵呵,管它呢!

 

7RACE那一套可以自己准备。分别购买,这样就不用担心只能做7次了。

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