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小颜登顶的人梯

(2019-05-19 18:34:38) 下一个

小颜登顶的人梯

科学的进步历来都不是前人栽树后人乘凉,而是一个前人为后来者搭人梯的过程,这么说不矛盾,因为这个意味着后人虽然因前人的工作受益,但他们却不能停下来坐享其成,而是要继续攀越,只有这样,科学才能发展和进步,不然大家只能活在CS中,变得愚昧落后。

小颜在葡萄糖转运体方面研究的成功也是借着前人搭的梯子攀登上去的。没有这个梯子,她的工作不是不可能,因为她用的工具X-光晶体结构分析能够直接看到蛋白的结构,但是这些人积累的知识却为她提出这个结构和机理增加了信心和佐证。

这几天城里人进行了一场大讨论,就是小颜在攀登高峰时踩的人梯有没有踩在大Yan那厚实的肩膀上。城里很多人相信她踩了,只是没有承认而已,现在被追问了,还说没踩,不仅说没踩,还有点不耐烦。城里另外一部分人则说她没踩,当时虽然看见大Yan的肩膀了,但不在她捷径上,所以没有弯过去踩他一脚,我属于后面这部分人中的一顽固分子。

在发多文后,依然有人觉得小Yan还是踩了大Yan的肩,为了看看她到底有没有踩,我们不妨来看看一篇由Mike M. Mueckler和Paul W. Hruz写的一篇关于《Structural analysis of the GLUT1 facilitative glucose transporter》的综述,我想和大家一起学学这篇文章,是因为这里面详细地记录一直到2009年对GLUT1的结构和功能研究的历史,这就是小Yan的研究方向和最终目的 (2012年左右开始暂露头角)。

我认为该文写得很好,是因为他们从一级结构一直讲到四元结构。一级就是直线的,意思就是说氨基酸序列和根据其推测的重要功能基团;二级结构就是在在直线的基础上的弯曲,这里重点是螺旋;三级结构是螺旋在三维空间里是怎么排列的;四元结构这里指的是单体,二聚体还是多聚体。除了几段我觉得对这些结构和机理的文可有可无而没有放上来外,关键的部分我和谷哥都把它门列上了,目的是为了看看那些为小Yan搭人梯的肩膀,最主要的就是看看有没有大Yan那宽厚的双肩。

一直到2009年的人梯中的肩膀基本上都看了,一共差不多有几百个肩膀,就是没有大Yan的 (如果有大Yan的肩膀,应该在93年/Cell paper和95年/PNAS paper之间),为什么?还是因为大Yan的肩膀在另外一个人梯里,不在小Yan走的捷径上,她就没有弯过去踩他一下,希望吃瓜群众看了这个以后,不要再跟风骂人家小Yan了,更不要打假,因为她的东西比前面所有人的干货都多。

所以,她没有弯道超车,不然就会睬着大Yan的肩膀了,因为她走的是捷径,所以没有弯过去踩大Yan一脚,明白了吧!

她的工作为什么那么重要,就是因为大家在用野路子连摸带猜辛辛苦苦多年后还不知道猜的结构到底是不是正确的时候,都一直都盼着像她那样的具有确定性的工作,就像综述最后说的: "虽然目前的关于GLUT1的结构/功能关系,包括图中(原文图三)显示的GLUT蛋白三级结构的模型的研究工作让人印象深刻,但所有的知识体系都仍然是推测性的。结构的最终确认必须等待技术进步,这些技术包括能让“促进转运蛋白”结晶和/或能纯化足够的功能蛋白用以在溶液状态进行结构分析。"

打个比方,大Yan和他那个时候走野路子的人就像是在盲人摸象,没有眼睛,摸来摸去,还是不知道大象到底什么熊样,而小Yan的X-光晶体技术就像是她的眼睛,一下就看清象是啥样了!

看了这个以后,再次喊打假前,好好想想吧!

Mike M. Mueckler和Paul W. Hruz 《Structural analysis of the GLUT1 facilitative glucose transporter》的链接:

https://www.tandfonline.com/doi/pdf/10.1080/09687680110072140 

下面一起来看看我辛辛苦苦搞得highlights(注不是所有的文献都列出了的):

一级结构

一,一九八五年被克隆 (Mueckler et al. 1985).

二,86-89年小鼠,大鼠,兔子和猪的GLUT1的cDNA被克隆 (Birnbaum et al. 1986, Asano et al. 1988, Kaestner et al. 1989). 发现GLUT1的氨基酸序列在不同的种中高度保留。

三,一九八五年Mueckler第一次提出GLUT1有12个特征性的跨膜α-螺旋,其中N-和C-末端都在胞浆内的结构 (Mueckler et al. 1985).

四,一九九三年有人提出一个不同的模型 (Fisch- barg et al. 1993), 但12跨膜α-螺旋的模型经得起不同的试验方法得到的资料考验。

二级结构

五,一九八七年有人用光谱学方法测得放在脂质体中从红细胞上分离出来的GLUT1的二级结构。发现

重构蛋白的傅里叶变换红外光谱显示出主要在α-螺旋结构中发现的振动和拉伸频率(Alvarezet al.,1987)。

六,一九八七年有人通过用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶对纯化的转运蛋白进行蛋白水解处理获得的GLUT1的膜内部分的光谱也显示出α-螺旋结构(Cairns等人,1987)。

七, 一九八六年GLUT1上的偏振傅立叶变换红外光谱重建成定向的多层脂质薄膜,确定12个跨膜α-螺旋排列几乎垂直于膜,倾斜小于388(Chin et al.1986)。  

八,一九八七有人通过对重构蛋白质的圆二色性数据获得了对GLUT1的主要α-螺旋含量的进一步支持。这些研究估计GLUT1由82%α-螺旋,10%b-转和8%无规卷曲结构组成(Chin等,1987)。

膜拓扑结构

12个跨膜螺旋的定向 细胞膜内的GLUT1已经通过几种独立技术得到验证。已经通过蛋白水解切割和免疫表位作图实验证实了C末端的细胞质定向和连接TM区段6和7的大序列。

(原文的图二,膜拓扑结构,显示有这个大家族共有的12螺旋结构

九, 一九八七有人通过在红细胞膜内的转运蛋白从细胞质侧暴露部分切割GLUT1产生分别对应于TM区段6±7环和c-末端内残基213±269和457±492的肽片段(Cairns等人,1987)。

十,一九九零年有人发现针对C-末端和大的胞内区r环的单克隆抗体仅在暴露于细胞质那一面时才能与转运蛋白结合(Davies等,1990)。

十一, 连接TM区段1和2的环的细胞外位置也通过GLUT1的ASN45处的单糖基化位点建立。一九九一年有人通过突变研究证实GLUT1的糖基化只发生在该位点上,该天冬酰胺残基的扰动可让所有糖基化的消除(Asano等人,1991)。

十二, 一九九三年有人用不渗透的生物素化试剂在完整细胞内标记Lys300证实连接TM区段7和8的环的在细胞外(Preston和Baldwin 1993)。

十三,一九九四年有人用不渗透的巯基定向试剂标记非洲爪蟾卵母细胞异源表达的GLUT1中的Cys429,这一结果也和与连接TM区段11和12的环位于细胞外的预测一致(Wellner等人,1994)。

十四,一九九四年有人用一种叫糖基化扫描突变术将每个跨膜螺旋之间的预测的链接都放上一个N-链接的糖基化序列最准确地得到了GLUT1的膜拓扑结构。

 三级结构

Mueckler等在一九八五年提出GLUT1结构的原始模型(Mueckler等,1985)预测了由五个TM a-螺旋并列形成的中央水通道的形成(即3,5,7,10 和11),每个都具有一些两亲性。

十五,Jung等人利用氘交换所得到的数据支持这个中心水通道的存在,这些数据显示 80%的GLUT1酰胺质子可被水性溶剂接近(Jung等人,1986)

十六,这个现象和GLUT1能促进水的转运是一致的(Fischbarg等,1990)

十七,一九八七年有人就提出哺乳动物和细菌糖转运蛋白是同源的。

十八,一九九三年Baldwin提出了包含两个不同的6螺旋结构的假设螺旋包装组合模型(Baldwin 1993)。

十九,在此基础上,Gould和Holman于一九九三年构建了详细的结构模型(Gould和Holman,1993)。

二十,Zeng和同事于一九九六年用GLUT1的分子模型考虑了水通道的大小,螺旋能量填充和宏观极性以及环长度,提出了两种可能的结构,其中螺旋排列成四束图案(Zeng等,1996)。

二十一,与pCMBS修饰相结合的半胱氨酸扫描诱变技术为几种TM残基的溶剂可及性提供了实验证据。在产生所有五种天然GLUT1结构185半胱氨酸已经突变为甘氨酸或丙氨酸的GLUT1分子后,这些实验成为可能。一九九四年,Wellner等发现无半胱氨酸转运蛋白保持接近野生型转运活性,说明GLUT1对突变很有耐受力(Wellner等,1994)。

二十二,以后几个研究组又相继对12个TMα-螺旋中的5个(2,5,7,10和11)进行了半胱氨酸扫描突变研究(Hruz和Mueckler 1999,2000,Makepeace和Mueckler 1999,Olsowski等2000)(螺旋10)(未发表的作品,C。Makepeace和M. Mueckler)。和整个编码序列已进行半胱氨酸扫描诱变大肠杆菌远缘相关的乳糖通透酶转运蛋白中观察到的结果类似(Frillingos等,1998),这些GLUT螺旋中的很少有半胱氨酸残基出现对运输活动至关重要。到2009该文截稿时,GLUT1中的106个半胱氨酸突变体中超过80%保留了大于50%的完全没有半胱氨酸的GLUT1的 2-DOG摄取活性。 五个螺旋所有的敏感残基都在细胞外面。根据这些结果,该综述的作者又提出了图上的一个各个螺旋如果排列的工作模型,并指出为了确立各个螺旋之间的距离还有很多工作要做。

(原文图三;盲人摸象之三级结构,其中中间那比较关键的五个螺旋当时已经有人做个多个突变试验,模型就是在此基础上连猜带蒙搞出来的,作者承认还有很多工作要做,谦虚!)

这里引用的 Frillingos等,小Yan也有引用,说明这个蛋白可能研究的比较透彻。或者相关性比较好。

瓶口(葡萄糖结合的地方)

下图是当时作者的瓶口模型,具体讲有五个螺旋组成了瓶口,并显示葡萄糖如果和瓶口上的各个部位通过氢键链接。这里引用的工作有:

二十三,早在一九七三年,该基因还没有克隆的时候,就有人已经通过研究各种在不同羟基被取代的葡萄糖类似物抑制运输活动的能力来研究与红细胞膜内的GLUT1分子中决定和葡萄糖结合的因素(Barnett et al.1973)

二十四,当时正在进行的螺旋-10的半胱氨酸扫描突变表明Glu-380确实可以被含水溶剂接近,在该位置突变导致运输活性显着降低(C. Makepeace和M. Mueckler,未发表的工作)

(原文图三;盲人摸象之瓶颈 - 原文没有称之为瓶颈,显示葡萄糖如何在入口处和该运载体结合,作者依然承认还有很多工作要做,再谦虚!)

四元结构

文里具体谈了一些试验资料证明GLUT1可能以单体,二聚体或者四聚体存在的证据或者可能性。

二十五,单体就有活性的资料 (Baldwin et al. 1981, Burant and Bell 1992).(Jarvis et al. 1986). (Pessino et al. 1991). (Lundahl et al. 1991).

二十六,支持以二聚体(Jacobs et al. 1987) 或者四聚体存在的证据 ((Hebert and Carruthers 1992).

文章的结论(Conclusion)之一:

 "虽然目前的关于GLUT1的结构/功能关系,包括图中(原文图三)显示的GLUT蛋白三级结构的模型的研究工作让人有很不错的印象,但所有的知识体系都仍然是推测性的。结构的最终确认必须等待技术进步,这些技术包括能让“促进转运蛋白”结晶和/或能纯化足够的功能蛋白用以在溶液状态进行结构分析。"

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评论
老泉 回复 悄悄话 没关系,鲁迅的读者那时也不多。认识一个人,也认识一下网络(来一个什么定理?)。老阎也常说真理(其相)往往掌握在少数人手里,到是小颜看到与老阎没chemistry 干脆不理了。
Fanreninus 回复 悄悄话 回复 'Rosaline' 的评论 : 如果有影响的话,根本不用自己这么宣传,我真希望自己有鲁迅的本事,这个事件是多好的人物和故事素材呀! :)
Rosaline 回复 悄悄话 我同意老泉的“喇叭口的模型”质疑, 和分析。
老泉 回复 悄悄话 因此这个讨论没有chemistry 。
Fanreninus 回复 悄悄话 回复 '老泉' 的评论 : 哈哈,这个是写博的,那激动也可以理解,只不过是他激动,人家小Yan也激动,不能自己激动,就不让人家激动了! :)
老泉 回复 悄悄话 再看看老阎的描述(喇叭口发现的喜悦): 看老阎的如下描述,好像是小说,不是学术研究。

“皮特(我老板Peter Maloney先生的名字)在打字,看到我喘不上来气一样,不知怎么回事,当即问:“润涛,发生了什么?”我一边喘气一边抹汗,然后把两胳膊合在一起,再把两手分开成喇叭口状。然后把两手的手指尖合在一起,手臂张开。反复重复这动作给他看。皮特看到我不说话而是胡乱比划,害怕我被将近三年搞出来了个无结果的结局给气疯搞成癫痫了,便仔细盯着我看。我跑到外边的实验室,拿两把板尺,都是一尺长,不用我的身体表演给他,而是用两把尺子继续表演喇叭口朝外转变成喇叭口朝里。他突然间明白了,我不是气疯了,而是在表演我的结果--葡萄糖载体的工作机理模型。

“葡萄糖载体蛋白的工作机理是这样的?”他惊喜地问。

六几年开始有人提出喇叭口,学术上用alternating access model. 但内含逐年增加。老阎九三年描述自己,好象不知道有喇叭口模型。Peter不看具体详细结果,凭老阎两手比划,也同意了喇叭囗机理。 由此,很多人认为老阎是画喇叭口第一人。
老泉 回复 悄悄话 回复 'Fanreninus' 的评论 : 我感觉第一文描述不靠谱。他先画小颜的喇叭口,再画自己的喇叭口。然后说他突然发现喇叭口,他老板也好象不知道有喇叭口这个机理,经过老阎一比划,同意了是老阎发现喇叭口机理。由此,有些人开始质问小颜。如果老阎第一文说他的贡献是喇叭口里面的小domain ,则大家会看细节。因此此文有误导。
Fanreninus 回复 悄悄话 回复 'SwiperTheFox' 的评论 : 哈哈,八股文风! :)
Fanreninus 回复 悄悄话 回复 'trendspike' 的评论 : 没有相关性!如果有的话,就像我在前面一文里说过的,小Yan引用也不会对她的Paper有任何影响,因为她用的方法,比起以前的那些“野路子”都是一次质的飞跃。
SwiperTheFox 回复 悄悄话 博主的题目均为七字,美观而且有才!!
trendspike 回复 悄悄话 Hurz没引用润涛工作,很有说服力。要是润涛真是革命性的发现,Hurz不可能不提。
Fanreninus 回复 悄悄话 回复 'cowwoman' 的评论 : 哈哈,我一下成为皇阿哥了! 大Yan可能也是被吃瓜群众纵容的,他的第一篇博文很靠谱的,后来却越走越偏了,这对他自己也不好,希望他能好好冷静一下,因为毕竟小Yan也没有否定他的成就,两个人都有成就,谁的重要不是自己说了算,要外人评论才对。
再说,这样搞对小Yan很不公平。
Fanreninus 回复 悄悄话 回复 'SwiperTheFox' 的评论 : 嗯嗯,等有时间再补充了。
cowwoman 回复 悄悄话 回复 'Fanreninus' 的评论 : 中坛有数篇肯定小颜和老阎无关的文章,您这篇又是从另一个角度深入讨论的佐证。我想老阎在博客发表他的高见,面对大部分没有科学素养的人,他出发点可能是有恶意的。读了他的文章,大家高看他无所谓,问题是伤害了小颜的名声就不好了。高人出来接招,不仅保护小颜,也保护了吃瓜群主。在此给皇阿哥点赞。
Fanreninus 回复 悄悄话 回复 '雨女' 的评论 : 嗯嗯,他的肩膀等着其他的美女去踩呢!:)
Fanreninus 回复 悄悄话 回复 '稳稳' 的评论 : 哈哈,厉害=电大+自学成才! :-)
Fanreninus 回复 悄悄话 回复 '山里人家168' 的评论 : 城里的居委会太厉害,现在已经不敢黄了! :)
Fanreninus 回复 悄悄话 回复 '老泉' 的评论 : 是的。 很多人多少年的心血和汗水,如果看到他们在结论里的话就知道为什么小Yan的东西那么重要,因为是前人根本就没法确定的东西。
Fanreninus 回复 悄悄话 回复 '过客手笺' 的评论 : 哈哈,欢迎回城。也有通俗的微型小说可以看的! :)
SwiperTheFox 回复 悄悄话 谢谢提供资料! 如果能强调一下小颜结晶 GLUT1 时所用的聪明推理与手段就更好了。
雨女 回复 悄悄话 超赞!你也认为看到肩膀了。我一直这么认为。但是,我不知道为什么没踩。现在你解释了没踩的理由。转走!
稳稳 回复 悄悄话 唉玛雅,这是俺电大校友吗?
山里人家168 回复 悄悄话 回复 '农村干部' 的评论 : 小宝要火,从写风花月夜摇身一变科学家了,又黄又专!保不准,过几年文学城大师非小宝莫属

+1
老泉 回复 悄悄话 非常详细。而且其机理更多复杂,不是简单alternative access, transporter有单体,二聚体,四聚体可能性。
过客手笺 回复 悄悄话 几天没来城里,再上来看时发现苗大哥的文章我读不懂了,越来越深奥了,是不是准备要文学城给你颁发科学院院士头衔呀?:))
Fanreninus 回复 悄悄话 回复 '农村干部' 的评论 : 谢谢,在农村的广阔天地里锻练出来的!
农村干部 回复 悄悄话 小宝要火,从写风花月夜摇身一变科学家了,又黄又专!保不准,过几年文学城大师非小宝莫属。提前祝贺(^-^)!
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